主要角色
宫小路瑞穗
出身名门镝木家的独生子，借母姓「宫小路」以女装身份转入圣应女子学院。虽为男性，却拥有超越女性的美貌与温柔气质。文武双全、精通护身术，但性格温软腼腆。因祖父遗愿进入女校后意外被选为第73代Elder Sister。其女装身份与真实性别之间的反差构成了全篇的核心戏剧冲突。宫小路瑞穗已成为ACG文化中伪娘角色的经典原型。
十条紫苑
瑞穗的同班同学，原华族十条家的独生女。外表端庄知性，但本质上喜欢恶作剧，经常和玛利亚一起捉弄瑞穗。因先天肺病曾休学一年，实际上是上一任（第72代）Elder Sister，代号「微笑的肖像」。为维系家族名誉曾与严岛家订立婚约，后在瑞穗的支持下勇敢追求自己的幸福。紫苑线是官方的核心主线。
周防院奏
瑞穗的学妹兼宿舍室友，负责照顾「姐姐大人」的日常起居。性格羞涩但非常努力，帮助瑞穗时会感到特别开心。戏剧部部员，经常因为入不了戏而烦恼。口头禅是在句末加上「なのですよ」。头上的丝带随情绪变化而变形。后来担任了演剧部部长和第74代Elder Sister，代号「白菊之君」。奏线结局中与瑞穗结婚并一同拍了毕业照。
御门玛利亚
瑞穗的青梅竹马，以祖父遗言为盾牌让瑞穗女装进入女校的「幕后推手」，并乐在其中。田径部成员，性格活泼开朗、行动力超群，经常为瑞穗乱出主意，搞得他团团转。虽然做事有时欠考虑，但始终是瑞穗最可靠的好参谋。代号「自由之风」。续作《少女爱上姐姐2》的主角妃宫千早是她的堂弟。与贵子从小关系恶劣，但后来有和好的倾向。
严岛贵子
圣应女子学院学生会长，严岛家大小姐继承人。作为才女型领袖，因瑞穗的转学导致自身影响力被大幅削弱，由此形成持续的对立关系。因家庭原因对男性存在深层厌恶，潜意识中可能察觉到了瑞穗的真实身份。经常进入被害妄想模式并突然自我封闭。TV动画版以贵子线为主要改编蓝本。虽然在绑架事件后认出了瑞穗的真实身份，但仍继续喜欢着他。
上冈由佳里
负责照顾玛利亚的后辈，同属田径部。与奏一样是宿舍的下级生。性格活泼开朗，但非常怕鬼。家境一般，是外部编入生，因此对周围人的小声议论异常敏感，常怀疑别人在议论自己。实际上她拥有比任何女孩子都更像女孩子的地方，内心细腻而温柔。后来担任了田径部部长及学生会会长，代号「琥珀之君」。续作中的皆濑初音是她的「妹妹」。
特别角色
高岛一子
住在瑞穗宿舍衣柜中的可爱幽灵少女，说话语速极快且有些啰嗦。生前是22年前照顾当时Elder Sister（正是瑞穗的母亲）的「妹妹」。因符咒被撕破而再次现身。她的愿望是与「姐姐大人」结婚，因此在得知瑞穗是男孩子后欣喜若狂。一子线是整个游戏中最具奇幻色彩和情感温度的路线。
梶浦绯纱子
圣应女子学院的国语教师兼三年A班班主任，同时拥有修女身份。第64代Elder Sister。离职后成为一名小说家，在续作《少女爱上姐姐2》中担任学院代理校长一职。作为隐藏攻略角色，她的路线从成年人的视角探讨了信仰、职业与情感之间的复杂关系。
配角群像
菅原君枝（第73代Elder、代号「辉夜之君」）、高根美智子（三年A班接待员）、小鸟游圭（演剧部部长）、门仓叶子（学生会第一黑幕、代号「帝之君」）、乌橘可奈子（学生会第二黑幕）等配角共同构成了圣应女子学院丰富多彩的校园生态。
声优阵容
《少女爱上姐姐》拥有豪华的声优阵容。PC版与TV动画版采用不同的声优配置，两个版本各有特色。TV动画版由堀江由衣（宫小路瑞穗）、松来未祐（十条紫苑）、神田朱未（周防院奏）、浅野真澄（御门玛利亚）、高桥智秋（严岛贵子）、松本彩乃（上冈由佳里）、后藤邑子（高岛一子）、榊原由依（梶浦绯纱子）等知名声优联袂出演，为角色注入了鲜活的生命力。