世界设定
圣应女子学院
圣应女子学院是一所拥有悠久历史与传统的大小姐学校，坐落于幽静的丘陵地带，被四季花木环绕。红砖校舍、哥特式礼拜堂、樱花林荫道和西式庭园构成了学院典雅庄重的景致。学院以培养「优雅而独立的女性」为教育理念，在学术、艺术、体育等各方面均有卓越成就。
学院最具特色的制度是「Elder Sister」（姐姐大人）——由全体学生投票选出一位高年级学生担任学院的精神象征。Elder Sister不仅需要品学兼优，更需要拥有令全校学生折服的品格魅力。每位Elder Sister都有专属的代号——如「微笑的肖像」「白菊之君」「辉夜之君」等，这些代号代代相传，成为学院传统的一部分。
核心设定：Elder Sister制度
Elder Sister制度是贯穿全篇的核心设定。每一位Elder Sister都有一个负责照顾其日常起居的低年级学妹——称为「妹妹」。这种配对制的姐妹关系并非简单的上下级关系，而是建立在深厚情感纽带上的特殊羁绊。许多「妹妹」最终会成为下一任Elder Sister，将这份传统延续下去。
宫小路瑞穗被选为第73代Elder Sister后，获得了代号「」。她的当选打破了学院的多项传统——不仅因为她是转学生，更因为她隐藏在女装之下的真实身份，为整个故事埋下了最大的戏剧冲突。
故事开端
故事的主人公镝木瑞穗出身于名门望族，自幼接受精英教育，文武双全。他容貌秀丽、性格温柔，因幼年与母亲的约定而一直留着长发，走在街上常被误认为是女孩子。按照常理，他将继承家业、步入精英社会——然而，祖父的遗言彻底改变了他的人生轨迹。
祖父在遗言中要求瑞穗以母亲「宫小路」的姓氏为名，转入其母曾经就读的圣应女子学院完成学业。面对这一不合常理的遗愿，瑞穗的青梅竹马御门玛利亚——以其遗言为盾牌——半强制地安排了瑞穗的女装入学计划。于是，宫小路瑞穗以女学生的身份，踏入了圣应女子学院的大门。
章节剧情
瑞穗以「宫小路瑞穗」之名初入圣应女子学院。陌生的环境、全新的身份、以及担心暴露真实身份的焦虑，让他在最初的几天里如履薄冰。然而，同班同学十条紫苑的友善与优雅让他感受到了一丝安心。与此同时，瑞穗在宿舍中遇到了负责照顾他的学妹周防院奏，以及从衣柜中突然出现的幽灵少女高岛一子。学院生活的一页就此翻开。
随着学院一年一度的Elder Sister选举临近，瑞穗的名字意外地出现在了候选人名单中。在紫苑、玛利亚和奏等人的支持下，瑞穗以压倒性的票数当选为第73代Elder Sister。这个结果让瑞穗本人感到无比羞耻，也让现任学生会会长严岛贵子产生了强烈的危机感与竞争意识。
成为Elder Sister后的瑞穗，日常变得愈发混乱。他需要处理来自各方的请求、调解学生间的矛盾、出席各种公开活动，同时还要在宿舍中应对奏和一子的各种「照顾」——这些日常生活充满了令人哭笑不得的喜剧情节。与此同时，瑞穗与各位女主角的情感羁绊也在点点滴滴的日常交流中逐渐加深。
圣应女子学院一年一度的学园祭是整个游戏叙事的关键转折点。在盛大的学园祭中，各条角色路线开始出现明确的分支。瑞穗在学园祭期间与不同女主角的互动，将决定后续剧情的走向——无论是与紫苑在星空下的对话、与玛利亚在田径场上的嬉闹、还是与贵子在学生会室中的对峙，都是决定结局的重要时刻。
圣诞舞会是Elder Sister在任期间最重要的任务——她需要与全校学生共舞，完成这一荣耀的仪式。然而，这也是瑞穗身份最易暴露的时刻。在舞会的准备和进行过程中，各条路线进入最终的情感高潮：贵子在绑架事件中认出了瑞穗的真实性别；紫苑在病痛与婚约的压力下做出了自己的选择；奏在戏剧舞台上找到了自信……每一条路线都以一场盛大而感人的圣诞舞会作为落幕。
分支路线与结局
主线（紫苑路线）
十条紫苑线是官方指定的主线剧情，讲述了瑞穗与紫苑从相遇到相知、从互相扶持到彼此救赎的完整故事。紫苑身为原华族之女，背负着家族荣誉与婚约的重压，同时还要与先天肺病抗争。瑞穗以Elder Sister的身份闯入她的世界，让她第一次真正地为自己而活。该路线的结局——在圣诞舞会上紫苑将自己全部的心意传达给瑞穗——被无数玩家奉为Gal史上的经典名场面。
贵子路线（动画主线）
严岛贵子线是TV动画版的主要改编蓝本，呈现了一段从对立到理解、从敌对到爱慕的情感历程。贵子身为严岛家的继承人，从小被灌输「男性是敌人」的观念。然而，当她逐渐发现瑞穗的真实身份后，根深蒂固的偏见与内心萌生的情感产生了剧烈的冲突。结局中贵子跨越了自我设限的藩篱，选择了忠于内心。
其他路线特色
玛利亚线充满欢乐与轻松，是最具喜剧色彩的路线；奏线温暖治愈，展现了最纯粹的「妹妹」对「姐姐大人」的仰慕与奉献；由佳里线关注一个普通女孩内心的成长与自信建立；一子线融入奇幻元素，在前世今生的交织中讲述了一段跨时空的温情故事；梶浦绯纱子线则从教师/修女的角度，探讨了成年人面对情感与信仰时的复杂心境。
主题与深度分析
性别认同与社会期待
《少女爱上姐姐》的核心母题是性别认同与社会期待之间的张力。瑞穗被迫以女性身份生活，这一设定并非简单的喜剧噱头，而是对性别角色与身份认同的深刻探讨。在女校中，瑞穗以「女性」的身份获得了尊重与爱戴——这与他作为「男性」时被期待承担的家业形成鲜明对比。作品通过这一设定，探讨了「性别」在多大程度上决定了社会对个体的期待和评价。
传统与现代的碰撞
圣应女子学院中充满了各种传统——Elder Sister制度、华族门第的婚约、家族的商业竞争……这些传统与角色们个人意志之间形成了持续的张力。每位女主角都在不同程度上与传统对抗：紫苑反抗家族安排的婚约、贵子挣脱对男性的偏见、由佳里克服出身带来的自卑。作品通过这些角色的成长，展现了「如何在尊重传统的同时追求个人幸福」这一普遍命题。